Мутанты для работы

Эти живые существа уже никогда не смогут жить на воле. Их геном многократно перекроен ради лишь одной задачи – без устали работать на человека.

Миллионы этих биороботов производят в огромных количествах то, что самим им практически не нужно. Они сопротивляются, они хотели бы жить по-другому, но кто же им это позволит?
За вводным пассажем, написанном в стиле антиутопии, на самом деле стоит обыденная реальность. Речь идет о микроорганизмах, специально адаптированных для работы в биотехнологическом производстве. Вообще-то микроорганизмы – бактерии и грибы – «вкалывают» на человечество с незапамятных времен, причем до открытий Луи Пастера люди даже не догадывались, что, замешивая дрожжевое тесто, сквашивая молоко, изготовляя вино или пиво, они имели дело с работой живых существ.
В поисках суперспособностей
Но как бы то ни было, интуитивно, методом стихийной селекции за тысячелетия людям удалось отобрать из природных, «диких» форм микроорганизмов высококачественные культуры для виноделия, сыроварения, хлебопечения. Другое дело, что уже в новейшую эпоху работящим бактериям были найдены новые применения. Возникли крупнотоннажные биотехнологические предприятия по производству, например, таких важных химических продуктов, как аминокислоты или органические кислоты.
Суть биотехнологического производства в том, что микроорганизмы, поглощая исходное сырье, например сахар, выделяют некий метаболит, продукт обмена веществ. Этот метаболит и является конечным продуктом. Проблема лишь в том, что в клетке присутствует несколько тысяч метаболитов, а производству нужен какой-то один, зато в очень больших количествах – например, 100 г/л (при том, что в естественных условиях метаболит вырабатывался бы в количествах, на два-три порядка меньших). Ну и разумеется, бактерии должны работать очень быстро – выдавать нужный объем продукта, скажем, за двое суток. Такие показатели диким формам уже не под силу – для этой «потогонной» системы требуются супермутанты, организмы с десятками различных модификаций генома.
Ближе к природе
Тут стоит задаться вопросом: а зачем вообще привлекать биотехнологии – разве химическая промышленность не справляется с производством тех же аминокислот? Справляется. Химия в наши дни может многое, однако у биотехнологий есть несколько серьезных преимуществ. Во-первых, они оперируют возобновляемыми ресурсами. Сейчас в качестве сырья в основном используются крахмало- и сахаросодержащие растения (пшеница, кукуруза, сахарная свекла). В будущем, как считается, будет активно применяться целлюлоза (древесина, солома, жмых). Химическая отрасль работает преимущественно с ископаемыми углеводородами.
Во-вторых, в основе биотехнологий лежат ферменты живых клеток, которые работают при атмосферном давлении, нормальной температуре, в водных неагрессивных средах. Химический же синтез протекает, как правило, при огромном давлении, высоких температурах, с использованием едких, а также взрыво- и пожароопасных веществ.
В-третьих, современная химия построена на применении каталитических процессов, а в роли катализаторов, как правило, выступают металлы.
Металлы не относятся к возобновляемому сырью, а применение их рискованно с точки зрения экологии. В биотехнологии функцию катализаторов выполняют сами клетки, и при необходимости клетки легко утилизовать: они разлагаются на воду, углекислый газ и небольшое количество серы.
И наконец, четвертое преимущество заключено в свойствах получаемого продукта. Например, аминокислоты являются стереоизомерами, то есть молекулы имеют две формы, обладающие одинаковой структурой, но пространственно организованные как зеркальные отражения друг друга. Поскольку L- и D- формы аминокислот по-разному преломляют свет, такие формы называют оптическими.
С точки зрения биологии, между формами есть существенное различие: только L-формы являются биологически активными, только L-форма используется клеткой как строительный материал для белка. При химическом синтезе получается смесь изомеров, извлечение из нее правильных форм – отдельный производственный процесс. Микроорганизм же, как биологическая структура, продуцирует вещества только одной оптической формы (в случае аминокислот – только в L-форме), что делает продукт идеальным сырьем для фармацевтики.
Битва с клеткой
Итак, задачу повышения производительности для биотехнологических производств природными штаммами решить нельзя. Необходимо использовать методы генной инженерии, чтобы фактически изменить стиль жизни клетки. Все ее силы, вся ее энергия, и все, что она потребляет, должно быть направлено на скудный рост и (в основном) на производство в больших количествах нужного метаболита, будь то аминокислота, органические кислоты или антибиотик.
Каким образом создаются бактерии-мутанты? В недавние времена это выглядело так: брали дикий штамм, затем проводили мутагенез (то есть обработку специальными веществами, которые повышают количество мутаций). Обработанные клетки рассевали, получали тысячи отдельных клонов. И были десятки людей, которые проверяли эти клоны и искали те мутации, которые наиболее эффективны в качестве продуцентов.
Наиболее перспективные клоны отбирали, и наступал черед следующей волны мутагенеза, и снова рассеивание, и снова отбор. По сути, все это мало чем отличалось от обычной селекции, давно используемой в животноводстве и растениеводстве, если не считать применение мутагенеза. Так десятилетиями ученые отбирали лучших из многочисленных поколений микроорганизмов-мутантов.
Сегодня используется иной подход. Все теперь начинается с анализа путей метаболизма и выявления основного пути конверсии сахаров к целевому продукту (а путь этот может состоять из полутора десятков промежуточных реакций). Ведь в клетке, как правило, присутствует много побочных путей, когда исходное сырье уходит на какие-то совсем не нужные производству метаболиты. И для начала все эти пути нужно отсечь, чтобы конверсия направлялась напрямую на целевой продукт. Как это сделать? Изменить геном микроорганизма.
Для этого используются специальные ферменты и небольшие фрагменты ДНК – «праймеры». При помощи так называемой полициклической реакции в пробирке можно вытащить из клетки отдельный ген, скопировать его в большом количестве и подвергнуть его изменению. Следующая задача – вернуть ген в клетку. Уже измененный ген вставляют в «вектора» – это небольшие кольцевые молекулы ДНК. Они способны переносить измененный ген из пробирки опять в клетку, где он замещает прежний, нативный ген. Таким образом можно ввести либо мутацию, которая полностью нарушает функцию ненужного производству гена, либо мутацию, которая изменяет его функцию.
В клетке существует очень сложная система, препятствующая производству в избыточном количестве какого-либо метаболита, того же лизина например. Естественным путем он вырабатывается в количестве примерно 100 мг/л. Если его оказывается больше, то сам лизин начинает ингибировать (замедлять) начальные реакции, ведущие к его производству. Возникает отрицательная обратная связь, исключить которую можно лишь с помощью введения в клетку очередной генной мутации.
Однако расчистить путь сырья к конечному продукту и снять встроенные в геном запреты на излишнее производство требуемого метаболита – это еще не все. Поскольку, как уже говорилось, формирование нужного продукта проходит внутри клетки определенное количество стадий, на каждой из них может возникнуть «эффект бутылочного горлышка». Например, на одной из стадий фермент работает быстро и промежуточного продукта производится много, а на следующей стадии пропускная способность падает и невостребованный избыток продукта угрожает жизнедеятельности клетки. Значит, необходимо усилить работу гена, который отвечает за медленную стадию.
Усилить работу гена можно, повысив его копийность – иными словами, вставив в геном не одну, а две, три или десять копий гена. Другой подход – «подшить» к гену сильный «промотер», или участок ДНК, отвечающий за экспрессию конкретного гена. Но «расшивание» одного «бутылочного горлышка», вовсе не означает, что оно не возникнет на следующей стадии. Тем более что факторов, воздействующих на течение каждой стадии получения продукта, очень много – необходимо учитывать их влияние и вносить коррективы в генную информацию.
Таким образом «соревнование» с клеткой может длиться долгие годы. На совершенствование биотехнологии производства лизина ушло примерно 40 лет, и за это время штамм «научили» вырабатывать за 50 часов 200 г лизина на литр (для сравнения: четыре десятилетия назад этот показатель равнялся 18 г/л). Но клетка продолжает сопротивляться, ведь такой режим жизнедеятельности для микроорганизма крайне тяжел. Работать в производстве она явно не хочет.
И потому, если регулярно не следить за качеством клеточных культур, в них неизбежно возникнут мутации, снижающие производительность, которые будут охотно подхвачены отбором. Все это говорит о том, что биотехнология – это не такая вещь, которую можно разработать однократно, а потом она будет действовать сама. И необходимость повышать экономическую эффективность и конкурентоспособность биотехнологических производств, и предотвращение деградации созданных высокопроизводительных штаммов – все требует постоянной работы, в том числе фундаментальных изысканий в области функций генов и клеточных процессов.
Остается один вопрос: а не являются ли организмы-мутанты опасными для человека? Что если они попадут из биореакторов в окружающую среду? К счастью, опасности никакой нет. Эти клетки ущербны, они абсолютно не приспособлены к жизни в естественных условиях и неизбежно погибнут. В мутантной клетке все так изменили, что она может расти лишь в искусственных условиях, в определенной среде, при определенном типе питания. Обратного пути в дикое состояние для этих живых существ уже нет.